Onderzoek naar alternatieve monstername voor moleculaire diagnostiek - VERMOLDIA

Dit onderzoek richt zich op een nieuwe methode voor het conserveren van drinkwatermonsters voor moleculaire diagnostiek. Het vermoeden is dat het RNA/DNA in watermonsters na bemonstering niet voldoende geconserveerd is, wat kan leiden tot een lagere detectie van bacterieel RNA/DNA bij gebruik van bepaalde diagnostische methoden. Bij de huidige methodes worden watermonsters van de tap in steriele flessen met conserveringsmiddel genomen waarna deze flessen bij 5°C naar het laboratorium verstuurd en bewaard worden en over het algemeen binnen 24 uur na monstername worden verwerkt. De Dual Filter Capsule (DFC) methode van Sylphium biedt een alternatieve methode voor monstername. De DFC methode bestaat uit een filter capsule voor monstername, conservering na bemonstering, en een isolatie kit. De filtratie wordt tijdens de monstername uitgevoerd en het RNA/DNA wordt direct geconserveerd in de capsule. Ook kunnen deze filter capsule bij kamertemperatuur worden bewaard en vervoerd. De DFC methode heeft potentie, maar is nog niet toegepast voor bacteriologische RT-(q)PCR, qPCR of next generation sequencing (NGS) onderzoek in drinkwater gerelateerde matrices. In dit project is een vergelijkingsonderzoek uitgevoerd in het laboratorium of de DFC methode een geschiktere methode is voor RNA/DNA onderzoek in drinkwatermonsters dan de huidige detectie methodes (flessenbemonstering, filtratie in het laboratorium, en DNA isolatie met kit). De DFC methode is getest voor detectie van Legionella pneumophila, waarbij de resultaten zijn vergeleken met de huidige detectie methode. De testen zijn uitgevoerd met kraanwatermonsters die zijn gemengd met oppervlaktewater en/of gecultiveerde cellen in verschillende concentraties. De DFC methode is effectief in het isoleren van DNA. Bij hoge concentraties L. pneumophila worden met de DFC methode ook hogere concentraties van de specifieke genen aangetoond dan met de huidige methode. Voor de lage concentraties zijn de resultaten van beide methodes vergelijkbaar. Voor conservering van RNA is de DFC methode getest voor detectie van E. coli en Enterococcen. Ook hier zijn verschillende testen uitgevoerd met kraanwatermonsters die zijn gemengd met oppervlaktewater, ijzer en mangaan houdend grondwater, en/of gecultiveerde cellen in verschillende concentraties. De isolatie van RNA met de DFC methode is nog niet optimaal. De Cq waarden van E. coli, Enterococcen en de interne controle zijn hoger (wat lagere aantallen gen kopieën betekent) en fluctueren minder per watermonster dan wordt waargenomen bij de huidige detectie methode. De RNA isolatie werkt beter voor gramnegatieve bacteriën dan voor gram-positieve bacteriën. Er wordt verwacht dat optimalisatie voornamelijk zit in het gebruiken van het eiwit lysozym (naast de chemische lysis) voor betere degradatie van de celwanden. Het is opvallend dat voor de RNA isolatie minder remming lijkt op te treden met de DFC methode in oppervlaktewater- en grondwatermonster in vergelijking met de huidige methode, naar alle waarschijnlijkheid komt dit door de isolatie kit van de DFC methode. De DFC methode heeft potentie om gebruikt te worden voor betere conservering van monsters, op basis van dit onderzoek, op dit moment alleen voor DNA analyses. In volgend onderzoek wordt aanbevolen om de mogelijk verminderde remming tijdens PCR verder te valideren met complexe water matrixen en organismen (voor DNA onderzoek), en om tijdsafhankelijkheid van het bewaren van de filter capsule mee te nemen. Ook kan er worden onderzocht of het opwerken van het volledige monster bij de DFC methode resulteert in lagere detectiegrenzen (momenteel wordt slechts 40-57% van het monstermateriaal gebruikt). Dit kan mogelijk ook worden behaald door een andere DNA isolatie kit te gebruikendan de kit die wordt meegeleverd met de DFC methode. Verder kan worden onderzocht of het gebruik van het eiwit lysosym (naast de chemische lysis) in de RNA/DNA isolatie kit van Sylphium een beter celwanden kapot kan maken en zo hogere RNA concentraties genereerd. Tot slot, kan onderzocht worden of de filter capsule gebruikt kan worden in de voorkweek voor Vitens.